key: cord-024171-x7y1xpsf authors: Bachmann, P. A. title: Rotavirusnachweis in Faezes: Erfahrungen mit dem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) date: 2010-05-13 journal: J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health DOI: 10.1111/j.1439-0450.1979.tb00795.x sha: doc_id: 24171 cord_uid: x7y1xpsf ZUSAMMENFASSUNG: 313 Kälber‐, 47 Ferkel‐ und 100 menschliche Faezesproben von an Durchfall erkrankten neugeborenen Patienten wurden mit Hilfe einer modifizierten Immunelektronenmikroskopie‐Technik (IEM) und im Enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) vergleichend untersucht. In 112 Kälber‐ (36%), 2 Ferkel‐ (4 %) und 21 (21 %) menschlichen Faezesproben konnte Rotavirus oder ‐antigen nachgewiesen werden. Die Sicherheit der Methodik wurde zusätzlich anhand der Virusausscheidung von drei experimentell infizierten, kolostrumfrei aufgezogenen Kälbern überprüft. Der ELISA, bei dem Meerrettichperoxidase als Enzym verwendet wurde, war spezifisch und erwies sich im Vergleich zur IEM als empfindlicher. Bei 18 von insgesamt 136 positiven Proben gelang der Virusnachweis nur mit der IEM, diese Proben waren negativ im ELISA. In diesen Proben werden Virus‐Antikörperkomplexe vermutet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, bevor der ELISA zum Rotavirusnachweis in der Routinediagnostik empfohlen werden kann. SUMMARY: Demonstration of Rotavirus in Faeces: Experiences with the Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 313 calf, 47 piglet and 100 human faecal samples from newborn patients with diarrhea were investigated comparing a modified immune electron microscopy method and the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). In 112 (36 %) calf, 2 (4 %) piglet and 21 (21 %) human samples rotavirus or its antigen could be demonstrated. The suitability of the method was also tested by studying virus shedding of three experimentally infected, colostrum‐deprived calves. The ELISA, using horse‐radish peroxidase as enzyme and 5 amino‐salicylic acid as indicator, was very specific and showed a higher sensitivity compared to IEM. In 18 out of the 136 positive samples rotavirus could only be demonstrated by IEM; these samples were negative in the ELISA. It is assumed that these samples contain virus‐antibody complexes. Further investigations are necessary before the ELISA can be recommended as a routine diagnostic test. RÉSUMÉ: Mise en évidence de Rotavirus dans des matières fécales: Expériences avec ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 313 maitères fécales de veaux, 47 de porcelets et 100 échantillons humains de patients nouveaux‐nés atteints de diarrhée ont été examinés en comparaison avec une technique immunologique modifiée en microscopie électronique (IEM) et avec ELISA. Rotavirus ou l'antigène ont pu être mis en évidence chez 113 veaux (36%), 2 porcelets (4%) et 21 enfants La fiabilité de la méthode a été en plus testée sur la base de l'excrétion du virus chez trois veaux infectés expérimentalement et privés de colostrum. (21 %). Le test ELISA, l'enzyme utilisée étant la peroxydase de Meerrettich, fut spécifique et s'est révélé plus sensible que IEM. La mise en évidence du virus a été possible dans 18 cas sur 136 positifs avec la méthode IEM, ces échantillons s'étant révélés négatifs avec ELISA. On a supposé l'existence de complexes virus‐anticorps dans ces échantillons. D'autres recherches sont nécessaires avant de pouvoir recommander le test ELISA pour la mise en évidence de Rotavirus dans le diagnostic de routine. RESUMEN: Identificación de virus Rota en heces: Experiencia con el Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Se examinaron comparativamente 313 muestras de heces de terneros, 47 de lechones y 100 de niños, pacientes recién enfermos de diarrea, con ayuda de una técnica modificada de inmunomicroscopía de electrones (IEM) y en el Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). En 113 muestras de heces de terneros (36 %), 2 de lechones (4 %) y 21 de niños (21 %) se pudo identificar virus o antígeno Rota. La seguridad de la metodología se controló además con ayuda de la eliminación de virus por tres terneros infectados experimentalmente, criados sin calostro. El ELISA, en el que se utilizó peroxidasa de rábano rusticano como enzima, era específico, resultando ser más sensible en comparación con la IEM. Solo en 18 de un total de 136 muestras positivas se logró la identificación de virus con la IEM, siendo estas pruebas negativas en el ELISA. Se sospecha que en estas muestras había complejos de anticuerpos de virus. Se precisa proseguir con las experiencias antes de poder recomendar el ELISA para la identificación de virus Rota en el diagnóstico de rutina. An dieser Stelle möchte ich Dr. D. Ellens und Dr. P. de Leeuw, Central Diergeneeskundig Instituut, Leystad, Holland, sehr herzlich für die Überlassung von Referenzmaterial und die Hilfe bei der Entwicklung des ELISA in unserem Labor danken. Der ELISA wurde als ,,Doppelte Sandwich-Technik" in Anlehnung an die von ELLENS und DE LEEUW (3) beschriebene Methode in Immunolon-Flachbodenmikroplatten (Flow Laboratories, Bonn) durchgefuhrt. Die Beschicbtung der Platten erfolgte rnit 100 pl der Anti-Rotavirus-Globulinlosung, die zuvor 1 : 8000 in 0,05 M Karbonat-Bikarbonatpuffer, p H 9,6 verdunnt worden war. Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden bei 37 OC und 16 Stunden bei 4 'C wurden die mit Folien verschlossenen Platten ohne weitere Behandlung bei -20 . ' C gelagert. Aktivitatseinbuden waren wahrend einer Lagerzeit von mindestens 6 Monaten nicht feststellbar. Vor Verwendung wurden die Platten aufgetaut und dreimal mit Aqua dest. mit 0,05 O/o Tween 20 grundlich gewaschen. AnschlieRend erfolgte die Beschidtung der Platten niit den aufbereiteten Faezesproben in den Verdunnungen 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 und 1 : 16. Bei jeder Platte wurden je eine bekannte Rotavirus-positive sowie -negative Faezesprobe in log 2-Verdiinnungen und eine PBS-Kontrolle mitgefiihrt. Nach Inkubation wahrend 3 Stunden bei 37 O C erfolgte dreimaliges Waschen mit Aqua dest / Tween 20, bevor 100 pl der Konjugatgebrauchsverdiinnung in PBS mit 5 "/o FKS in jede Vertiefung der Mikroplatten pipettiert wurden. Im Anschlud an eine weitere Inkubation von 1 Stunde bei 37'C und dreimaligem Waschen wurde das Enzymsubstrat rnit dem Indikator in die Vertiefungen gegeben. HESS, unveroff. Ergebnisse, 1979) . Bei diesen Proben konnte es sich um ein gleichzeitiges Vorkommen von Viruspartikeln und Antikorpern handeln, die als Komplexe vorliegen. Rotavirus-Immunglobulin-G-Komplexe in menschlichen Stuhlproben sind bekannt (21). Derartige Virus-Antikorper-Komplexe wurden im ELISA, mit dem antigene Eigenschaften festgestellt werden, nicht reagieren, mit Hilfe der IEM aber gut nachgewiesen werden konnen. Auf einen solchen Zusammenhang weisen WATANABE und Mitarbeiter (22) hin. Die Ursachen der Diskrepanz beim Rotavirusnachweis, die hier zwischen der IEM und dem ELISA festgestellt wurde, mussen in weiteren Untersuchungen abgeklart werden. Unsere Ergebnisse weisen jedoch darauf hin, dai3 beim Nachweis von Rotavirusantigen in Faezes unter alleiniger Verwendung des ELISA, wie das in friiheren Arbeiten empfohlen worden ist (3, 23), damit gerechnet werden mui3, dai3 eine Reihe von Rotavirus-enthaltenden Proben derzeit nicht diagnostiziert werden konnen. Eine Verbesserung der unbefriedigenden Resultate ware sicher moglich, wenn die Proben fruhzeitig, d. h. sofort nach Krankheitsbeginn entnommen wurden oder wenn von einem Patienten mehrere an aufeinanderfolgenden Tagen entnommene Faezesproben untersucht werden. Die Sicherheit der Methodik wurde zusatzlich anhand der Virusausscheidung von drei experimentell infizierten, kolostrumfrei aufgezogenen Kalbern uberpriift. Der ELISA, bei dem Meerrettichperoxidase als Enzym verwendet wurde, war spezifisch und erwies sich im Vergleich zur IEM als empfindlicher. Bei 18 von insgesamt 136 positiven Proben gelang der Virusnachweis nur mit der IEM, diese Proben waren negativ im ELISA. In diesen Proben werden Virus-Antikorperkomplexe vermutet. Weitere Untersuchungen sind notwendig, bevor der ELISA zum Rotavirusnachweis in der Routinediagnostik empfohlen werden kann. Experiences with the Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 313 calf, 47 piglet and 100 human faecal samples from newborn patients with diarrhea were investigated comparing a modified immune electron microscopy method and the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). In 112 (36 O/u) calf, 2 (4 O / o ) piglet and 21 (21 O / o ) human samples rotavirus or its antigen could be demonstrated. The suitability of the method was also tested 'by studying virus shedding of three experimentally infected, colostrum-deprived calves. The ELISA, using horse-radish peroxidase as enzyme and 5 amino-salicylic acid as indicator, was very specific and showed a higher sensitivity compared to IEM. In 18 out of the 136 positive samples rotavirus could only be demonstrated by IEM; these samples were negative in the ELISA. It is assumed that these samples contain virus-antibody complexes. Further investigations are necessary before the ELISA can be recommended as a routine diagnostic test. Identificacih de virus Rota en heces: Experiencia con el Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Se examinaron comparativamente 313 muestras de heces de terneros, 47 de lechones y 100 de niiios, pacientes recikn enfermos de diarrea, con ayuda de una tkcnica modificada de inmunomicroscopia de electrones (IEM) y en el Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). En 113 muestras de heces de terneros (36 O/O), 2 de lechones (4 O/o) y 21 de nifios (21 O/o) se pudo identificar virus o antigen0 Rota. La seguridad de la metodologia se control6 ademas con ayuda de la eliminaci6n de virus por tres terneros infectados experimentalmente, criados sin calostro. El ELISA, en el que se utiliz6 peroxidasa de ribano rusticano como enzima, era especifico, resultando ser mis sensible en comparacidn con la IEM. Solo en 18 de un total de 136 muestras positivas se logr6 la identificaci6n de virus con la IEM, siendo estas pruebas negativas en el ELISA. Se sospecha que en estas muestras habia complejos de anticuerpos de virus. Se precisa proseguir con las experiencias antes de poder recomendar el ELISA para la identificacibn de virus Rota en el diagn6stico de rutina. Enzyme-labelled immunosorbent assay techniques in foot-and mouth disease virus research Peroxidase labelled antibody and Fat, conjugates with enhanced intracellular penetration Enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of rotavirus infections in calves Elisa for the detection of bovine coronavirus in faeces. Abst. 4th Intern. Congress for Virology Corn arison of five diagnostic methods for the detection of rotavirus antigens in calf faeces Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistr rfber den Einsatz der Airfuge in der elektronenmikroskopischen Virusdiagnostik Comparison of an enzymelinked immunosorbent assay for quantitation of rotavirus antibodies with complement fixation in an epidemiological survey Detection of antibodies specific for herpes simplex virus in human sera by the enzyme-linked immunosorbent assay Detection of antibody to rubella virus by enzyme-linked immunosorbent assay Detection of hepatitis B surface antigen (HBsAg) with use of alkaline phosphatase labelled antibody to HBsAG Detection of adenovirus by enzymelinked immunosorbent assay Solid phase enzyme-linked immunosorbent assay for detection of hepatitis A virus Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of hepatitis A antigen in sera: Comparison with solid-phase radioimmunoassay, immune electron microscopy, and immune adherence hemagglutination assay Solid-phase enzyme immunoassay for herpes simplex virus Sensitivity of enzymelinked immunosorbent assay, complement fixation, and hemagglutination inhibition serological tests for the detection of Sendai virus antibody in laboratory mice Application of enzyme-linked immunosorbeiit assay (ELISA) to the detection of calf rotavirus and rotavirus antibodies Immunoassay using antigenenzyme conjugates Enzyme-linked immunoassays for antibodies in measles, cytomegalovirus infections and after rubella vaccination Detection of soluble Epstein-Barr virus by enzyme-linked immunosorbent assay Filter paper solid-phase radioimmunoassay for human rotavirus surface immunoglobulins Human rotavirus and its antibody: their coexistence in feces of infants Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of human reovirus-like agent of infantile gastroenteritis Adresse des Autors: Institut fur Medizinische Mikrobiologie, Infektions-und Seuchenmedizin