key: cord-309415-77b5erfj authors: Nguyen, T. D.; Bernard, S.; Bottreau, E.; Lantier, I.; Aynaud, J. M. title: Étude comparée de trois souches du coronavirus de la gastroentérite transmissible: Conditions de la réplicationvirale et de la synthèse des antigènes structuraux date: 1987-09-30 journal: Annales de l'Institut Pasteur / Virologie DOI: 10.1016/s0769-2617(87)80018-7 sha: doc_id: 309415 cord_uid: 77b5erfj Summary Purdue-115 and D-52 strains of TGEV were compared with the 188-SG strain, which was obtained by means of a survivor selection process in gastric juice of adult pig. The 188-SG strain was characterized by (a) low infectivity, (b) delayed and restricted growth associated with low and delayed RNA synthesis, and (c) a high content of structural antigens. In contrast, Purdue-115 and D-52 strains were characterized by (a) high infectivity, and (b) a normal pattern of virus replication and RNA and structural antigen synthesis. Tunicamycin induced the inhibition of synthesis of El and E2 glycoproteins (detected by the ELISA test using monoclonal and polyclonal antibodies) as well as a significant reduction in the NP protein. The inhibitory effect of tunicamycin was influenced by the cell type and virus strain. La gastroenterite transmissible (GET) est une enterite neonatale mortelle, hautement contagieuse, causee par un coronavirus specifique de l'espece porcine; Ia GET est responsable de lourdes pertes economiques en production porcine. La relation entre Ie pouvoir pathogene du virus et d'eventuels marqueurs in vitro lies par exemple aux conditions de sa replication, fait encore l'objet de controverse [9, 11, 14, 17] . Apres un certain nombre de passages en serie sur culture cellulaire, le virus OET perd une grande partie de son pouvoir pathogene. Des resultats recents suggerent qu'Il n'est pas possible de distinguer la souche attenuee 188-S0 (utilisable comme vaccin vivant oral chez la truie en vue de l'induction de l'immunite lactogene) des souches D-52 (dont la souche 188-S0 tire son origine) et Purdue-115 (souche americaine de reference), par l'etude des conditions d'attachement in vitro des particu-Ies virales (Ann. Rech. veterin., 1987, sous presse). C'est pourquoi nous avons entrepris l'etude comparee de la replication de ces trois souches de virus GET dans deux systemes cellulaires differents : les cellules ST (testicule de pore) et les cellules RPD (rein de pore). Nous avons con centre nos efforts d'une part sur l'etude de la cinetique des syntheses vir ales et, d'autre part, sur l'analyse des antigenes structuraux du virus produit a la fin du cycle, al'aide d'une batterie d'anticorps monoclonaux specifiques du virus OET. La resistance de la souche 188-S0 al'acidite et aI'action des enzymes proteolytiques [1] suggere l'existence probable de changements structuraux ou conformationneIs, qui pourraient etre lies aux conditions de glycosylation des proteines virales. C'est pourquoi nous nous sommes aussi interesses aI'influence d'une substance connue pour son activite a ce niveau: la tunicamycine. Cellutes. La lignee de cellules de rein de pore RPD a ete decrite precedemrnent [14] . La lignee de cellules de testicules de pore ST [16] a ete fournie par le Dr E.H. Bohl (Wooster, Ohio, USA). Ces cellules sont cultivees en milieu MEM (milieu essentiel minimal) additionne de serum de fcetus de veau (10 %). La souche Purdue-US, qui a subi 115 passages sur cultures cellulaires, a fait I'objet de nombreuses publications [3, 8, 14, 19] Cinetlque de la synthase de l'ARN, des proteines et de la formation virale en cycle unique. Decrite precedemment [1] , la technique pour I'etude du developpement du virus en cycle unique a He reprise pour examiner la synthese de l' ARN et des proteines et la formation des particules infectieuses virales. Les modifications suivantes ont ete apportees : apres l'attachement du virus, 1esinoculums ont ete elimines par deux lavages. Le milieu MEM additionne de 1 ug/rnl d'actinomycine D et de 0,2 fiCi/ml d 'uridine au de leucine tritiees, a ete utilise pour la culture des cellules infectees, qui ant ete ensuite mises aincuber a37°C. Preleves en fonction du temps, les echantil-Ions (0,1 ml chacun) ant ete deposes sur des papiers filtre (Titertek cell harvester filter, Flow Laboratories). Apres trempage pendant 1 h it 4°C dans de l'acide trichloroacetique 5 070, ces papiers sont rinces trois fois avec de l'alcool a70°et seches. La radioactivite de l'uridine au de la leucine tritiee incorporee dans les macromole- Les antigenes viraux neoforrnes sont titres al'aide d'un test ELISA. L'effet inhibiteur de la tunicamycine sur Ie rendement de la multiplication virale est exprime par la baisse du titre infectieux et de la densite optique pour le test ELISA. Titrage des antlgenes structuraux du coronavirus GET it I'aide d'une technique ELISA mixte. Anticorps monoclonaux anti-coronavirus GET. -Une batterie d'anticorps monoclonaux de souris specifiques du virus OET a ete preparee recemment [15] . Un certain nombre d'entre eux ant ete fournis par H. Laude et utilises dans cette etude (tableau I). Anticorps polyclonal anti-coronavlrus GET_ -Le serum de la truie n°5215, qui a ete utilisee dans une etude anterieure [1] , a servi a la preparation de l'anticorps polyclonal. Cette truie a ete vaccinee par voie orale avec la souche 188-S0 (8 semaines avant la mise-bas) et la portee de porcelets a ete eprouvee (au 4 e jour d'age); le serum recolte lors de I' abattage (deux semaines apres la mise-bas) presente un titre neutralisant de 65.000. Preparation du conjugue, -Le marquage des anticorps al'aide de la peroxidase a ete realise selon la technique de Nakane et Kawaoi [18] . Detection des antlgenes structuraux du coronavirus de la GET. -L' application de la technique ELISA-sandwich [7] aux etudes virologiques et immunologiques de la GET a ete developpee recemment [2] . La particularite de cette technique est la suivante: 1) la sensibilisation des plaques plastiques (Nunc, Immunoplate II, inter. 1) Cinetique d'apparition des particules infectieuses. -Quel que soit Ie systeme cellulaire, la souche 188-S0 se distingue des deux autres souches par un allongement de la phase de latence ( fig. 1c et If). En particulier dans les cellules RPD, on observe un retard d'environ 3 h. De plus, la production de la souche 188-S0 ne represente que 10 070 de celle des deux autres souches. Cependant, la phase exponentielle presente une pente similaire pour les trois souches. Par rapport aux cellules RPD, les cellules ST offrent au virus OET des meilleures conditions pour sa replication puisque celle-ci est plus precoce et plus productive (titres infectieux plus eleves), 2) Cinetique de la synthese de I'ARN et des proteines virales. -Presentes par la figure 1 (a, b, d, e), les resultats sont les suivants. Par rapport aux deux autres souches, la souche 188-S0 est caracterisee par une incorporation plus faible d'uridine tritiee. En revanche, la souche 188-S0 presente une incorporation plus importante de la leucine tritiee, en particulier dans les cellules ST, ce qui suggere un niveau de synthese de proteines plus elevee, Enfin, Ie systerne cellulaire a une influence importante: on constate en effet que la synthese de I'ARN viral dans les cellules ST est presque le double de celle qui est observee dans les cellules RPD. Notons par ailleurs que la synthese de l'ARN cellulaire est pratiquement negligeable en presence d' 1 [J.g/ml d'actinomycine D. Analyse des antlgenes structuraux du virus GET produit a la fin du cycle. .. . . .: :- souche D-52 presente de facon generale un comportement identique a celui de la souche Purdue-115 (resultats non presentes). En resume, ces resultats mettent en evidence l'abondance particuliere d'antigenes structuraux synthetises par la souche 188-S0 en culture cellulaire. Influence de la tunicamycine sur Ie rendement en particules infectieuses. L'addition de la tunicamycine dans le milieu a pour effet de diminuer le rendement en virus infectieux ( fig. 4 ). L'effet inhibiteur de la tunicamycine est plus intense a la concentration de 1 ug/ml pour la souche 188-S0. Par contre, pour les autres souches, on observe un effet inhibiteur proportionnel a la concentration de tunicamycine. De plus, on constate les faits suivants: dans les cellules ST, la multiplication virale de la souche 188-S0 est plus affectee par la tunicamycine que celie des autres souches ; inversement, dans les cellules RPD, la sensibilite ala tunicamycine est differente ; la souche 188-S0 est mains affectee que les deux autres souches virales. Influence de la tunicamycine sur la synthese des antigenes structuraux. La determination quantitative, par ELISA, des antigenes viraux contenus dans les suspensions virales demontre qu'en presence de la tunicamycine la synthese globale des proteines virales diminue parallelement ala formation des particules infectieuses ( fig. 5 ). Les resultats de la reaction ELISA mettant en oeuvre les anticorps monodonaux, demontrent que la synthese non seulement des glycoproteines mais aussi de la nucleoproteine est affectee par l'addition de la tunicamycine ( fig. 6 ). Influence du traitement du virus seml-purlfle par le metaperiodate sur son aetlvlte antlgenlque. Cette experience a ete menee atitre de controle pour permettre de savoir si I'alteration des parties glycosidiques des glycoproteines virales avait, ou non, une influence significativesur l'activite antigenique du materiel viral etudie dans ces conditions experimentales (ELISA). Pour cela nous avons choisi le metaperiodate dont les interactions sur les sucres sont connues [4] . Le traitement d'une suspension virale (souche Purdue-115) semi-purifiee par ultracentrifugation n'a pas d'influence significative sur l'expression de l'activite antigenique, en ELISA, des glycoproteinesEl et E2 jusqu'a la dose de 6 ug/rnl. Les antigenes structuraux sont titres par un test ELISA utilisant, pour la sensibilisation des plaques, un melange des differents anticorps monoclonaux specifiques de chacune des trois proteines virales, et, pour la revelation, l'anticorps polyclonal 5215. La difference de la synthese des proteines entre les deux types de cellules, est determinee par celie propreaux cellules (synthese endogene) plutot que par l'influence de la multiplication virale. Quelle que soit la souche, il est interessant de noter que les conditions de synthese des proteines sont differentes dẽ celle de I' ARN. Dans le cas de la souche 188-S0, le faible niveau observe dans la synthese d'ARN et dans l'apparition de particules infectieuses mais non dans la synthese de proteines, n'a pas encore d'explication. Pour la souche 188-Sa, it existe un nombre eleve de particules virales physiquement completes qui ne sont pas toutes infectieuses quel que soit le systeme cellulaire. En effet, malgre une quantite plus faible de particules infectieuses, Dans les cellules ST, la tunicamycine a un effet inhibiteur sur la formation du virus infectieux plus prononce pour la souche 188-S0 que pour les autres souches. En revanche dans lescellules RPD, un effet inverse est observe. Ainsi, il semble que la souche 188-S0, resistante al'acidite et aux proteases digestives, est plus vulnerable a l'inhibition de la glycosylation. Les conditions de glycosylation des proteines sont dependantes de la machinerie cellulaire [5, 6] . La difference d'activite de la tunicamycine observee entre les deux types de cellules pour une souche virale confirme cette observation. Nos resultats experimentaux montrent egalernent que la synthese non seulement des glycoproteines mais aussi des proteines non glycosylees (NP) est diminuee en presence de tunicamycine. Nos resultats confirment done que les proteines El et E2 du coronavirus OET sont toutes les deux N-glycosyIees [10] . Par ailleurs, il est interessant de noter que l'inhibition de la synthese des proteines El et E2 entraine parallelement une diminution de la synthese de la proteine NP. Dans le cas du virus de I'hepatite murine, la tunicamycine n'inhibe que la synthese de proteine E2 [21] . Ainsi, dans le cas du virus OET la synthese de El et E2 pourrait intervenir dans la regulation de la synthese des autres composants du virus de la GET, dont la proteine NP. Cependant, nos resultats ainsi que ceux de Rottier et coIl. [20] apartir du virus de I'hepatite murine montrent que, en presence de la tunicamycine, des particules virales infectieuses continuent aetre formees, bien que moins nombreuses « 1 0/0). Selon Holmes et colI. [12] , en presence de la tunicamycine, des particules virales «nues » (depourvues de spicules)sont formees et depourvues de pouvoir infectant. On sait en outre que la tunicamycine inhibe completernent la production de virus infectieux de l'herpesvirus bovin [22] . Les limites de la technique ELISA (reactions positives detectables apartir de 10 5 particules infectieuses) ne nous permet pas de determiner si ces particules infectieuses produites en presence de tunicamycine sont « nues » ou pas. Le probleme majeur qui s'est pose lors de la mise en oeuvre de la technique ELISA etait l' antigenicite des proteines virales synthetisees en presence et en absence de tunicamycine. Les arguments suivants sont en faveur d'une reactivite identique de ces proteines avec les anticorps monoclonaux: (1) les apoproteines, El et E2, reagissent avec les anticorps induits par les virus complets [10, 13]; (2) nous n'avons pas constate de difference dans le pouvoir neutralisant des anticorps sur le virus cultive sur cellules ST ou sur cellules RPD, malgre la difference de la sensibilite atunicamycine; et (3) le traitement du virus purifie par le metaperiodate, qui modifie profondement les parties glycosydiques des glycoproteines, n'a pas d'influence significative sur l'antigenicite des proteines virales evaluee al'aide de la technique ELISA, sauf pour les concentrations de metaperiodate qui affectent egalement la nucleoproteine (NP) non glycosylee; toutefois cet argument n'est valable que pour les epitopes 51. 13 -enfin, quelle que soit la souche de virus, l'inhibition de la synthese des proteines El et E2 -par le biais de l'inhibition de la N-glycosylation par la tunicamycine -entraine une diminution sensible de la formation de la proteine NP non glycosylee. Transmissible gastroenteritis (TOE) of swine: survivor selection of TGE virus mutants in stomach juice of adult pigs Detection of transmissible gastroenteritis coronavirus by a sandwich ELISA technique Antibody response in serum, colostrum and milk of swine after infection or vaccination with transmissible gastroenteritis virus The periodate oxydation of amino acides with references to studies of glycoproteins Sindbis virus glycoproteins are abnormally glycosylated in Chinese hamster ovary cells deprived of glucose Alteration in the hemagglutinin associated with adaptation of influenza B virus to growth in eggs Enzyme-linked immunosorbent assay. -III. Quantitation of specific antibodies by enzyme labeled antiimmunoglobulin in antigen coated tubes Local and systemic cell-mediated immunity against transmissible gastroenteritis, an intestinal infection of swine Comparison of properties between virulent and attenuated transmissible gastroenteritis virus Defective replication of porcine transmissible gastroenteritis virus in a continious cell line In vitro differenciation and pH sensitivity of field and cell culture attenuated strains of transmissible gastroenteritis virus Analysis of the fonctions of coronavirus glycoproteins by dfferential inhibition of synthesis with tunicamycin Cloning and expression of the surface glycoprotein gp 195 of porcine transmissible gastroenteritis virus In vitro properties of low and high passaged strains of transmissible gastroenteritis coronavirus of swine Antigenic structure of transmissible gastroenteritis virus. -I. Properties of monoclonal antibodies directed against virion proteins Studies on transmissible gastroenteritis of swine. -II. Selected characteristics of a cytopathogenic virus common to five isolants from transmissible gastroenteritis Physicochemical properties of field and cell culture-attenuated strains of swine transmissible gastroenteritis (TGE) coronavirus Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation Neutralizing secretory 19A and IgG do not inhibit attachment of transmissible gastroenteritis virus Viral protein synthesis in mouse hepatitis virus strain A59-infected cells: effects of tunicamycin The structure and behaviour of coronavirus Effects of tunicarnycin and monensin on biosynthesis, transport and maturation of bovine herpes virus type 1 glycoproteins