key: cord-300395-87bl6e38
authors: Behrmann, Ole; Bachmann, Iris; Hufert, Frank; Dame, Gregory
title: Schnellnachweis von SARS-CoV-2 mit recombinase polymerase amplification
date: 2020-10-14
journal: Biospektrum (Heidelb)
DOI: 10.1007/s12268-020-1458-3
sha: 
doc_id: 300395
cord_uid: 87bl6e38

The COVID-19 pandemic highlights the need for fast and simple assays for nucleic acid detection. As an isothermal alternative to RT-qPCR, we outline the development of a detection scheme for SARS-CoV-2 RNA based on reverse transcription recombinase polymerase amplification (RT-RPA) technology. RPA uses recombination proteins in combination with a DNA polymerase for rapid amplification of target DNA at a constant temperature (39–42 °C) within 10 to 20 minutes and can be monitored in real-time with fluorescent probes.

BIOspektrum | 06.20 | 26. Jahrgang initiiert, was zu einem exponentiellen Kopierprozess der Ziel-DNA führt.

Als weitere Komponenten sind dNTPs als Bausteine für die DNA-Synthese sowie ATP als Energiequelle und hochmolekulares PEG zur Steigerung der Reaktivität im RPA-Mix enthalten. Durch Hinzufügen einer reversen Transkriptase (RT) kann die RPA-Reaktion auch zum Nachweis von RNA verwendet werden. Hierfür erfolgt zunächst die Synthese komplementärer DNA (cDNA) ausgehend von dem zur Ziel-RNA komplementären Primer. Die so entstandene komplementäre DNA wird sofort vom eigentlichen RPA-Mechanismus erkannt und, wie zuvor beschrieben, kopiert. Die für die RPA verwendeten Primer sind mit 30 nt bis 35 nt länger als typische PCR-Primer, da nicht die Schmelztemperatur, sondern die Bindungsfähigkeit an UvsX für die Funktionalität bestimmend ist [6] . The COVID-19 pandemic highlights the need for fast and simple assays for nucleic acid detection. As an isothermal alternative to RT-qPCR, we outline the development of a detection scheme for SARS-CoV-2 RNA based on reverse transcription recombinase polymerase amplifi cation (RT-RPA) technology. RPA uses recombination proteins in combination with a DNA polymerase for rapid amplifi cation of target DNA at a constant temperature (39-42 °C) within 10 to 20 minutes and can be mo nitored in real-time with fl uorescent probes. DOI: 10.1007/s12268-020-1458-3 © Die Autoren 2020 ó Die derzeitigen Protokolle zur Diagnose von SARS-CoV-2-Infektionen beruhen auf der quantitativen reversen Transkriptions-PCR (RT-qPCR) für den Direktnachweis der viralen RNA [1] . PCR-basierte Methoden sind jedoch aufgrund des notwendigen energieintensiven Thermocyclings für schnelles und dezentrales Screening vor Ort schwierig umsetzbar. Alternativ sind seit einigen Jahren isotherme Verfahren -wie die loop-mediated isothermal amplifi cation (LAMP) [2] oder die recombinase polymerase amplification (RPA) [3] -verfügbar, welche der PCR hinsichtlich Sensitivität und Spezifi tät gleichwertig sind. Diese Methoden erfordern keine hochent wickelten Thermocycling-Instrumente und beruhen auf enzymatischen Prozessen. Aufgrund ihres vergleichsweise einfachen Design ansatzes, milder Prozesstemperatur (39-42 °C), einer rasanten Amplifi kationsgeschwindigkeit (10-20 min.) und der Verfügbarkeit von Reagenzien in lyophilisierter Form sehen wir die RPA als vielversprechende isotherme Nukleinsäure-Nachweismethode für die Vor-Ort-Diagnostik (Point-of-Care-Testing, POCT) an. Aufbauend auf vorhergehenden Arbeiten, in welchen der Nachweis anderer Coronaviren wie MERS-CoV [4] und Bovines Coronavirus (BCoV) [5] mittels RPA demonstriert wurde, stellen wir in diesem Artikel die Entwicklung eines RPA-Assays für den Schnellnachweis von SARS-CoV-2 vor. Zusätzlich zum eigentlichen Assay design präsentieren wir auch einen neuartigen Ansatz für die Konstruktion von fl uoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden für den Echtzeitnachweis der RPA.

Funktionsprinzi p der recombinase polymerase amplifi cation (RPA) Das 

Das für den Virusnach w eis gewählte Zielgen muss hochspezifi sch sein und einer geringen Mutationswahrscheinlichkeit unterliegen sowie vorzugsweise etwa 1 kb lang sein, um genügend Flexibilität in der Positionierung der RPA-Primer und exo-IQ-Sonde zu gewährleisten. Im Fall der Coronaviren bietet sich hierfür das Nukleoprotein-Gen (N-Gen) mit einer Länge von etwa 1,2 kb an, da dieses zusätzlich während der viralen Replikation auch in sehr hoher Kopienzahl vorliegt, wodurch die diagnostische Sensitivität erhöht werden kann. Geeignete RPA-Primerund Sondensequenzen konnten bisher lediglich semi-automatisch unter Zuhilfenahme von angepasster PCR-Designsoftware erstellt werden. Seit 2019 kann dies jedoch mit PrimedRPA [9] erfolgen, der ersten Designsoftware speziell für RPA-exo-Assays. Ausgehend von diesen Daten werden zunächst alle Sonden ausgewählt, welche ein Thymin an Position 30 besitzen und die gewählten Sequenzen werden mittels Alignment auf ihre Selektivität bezüglich der gewünschten Zielsequenz geprüft. Bei der Entwicklung einer SARS-CoV-2-RPA muss hier insbesondere auf die Selektivität gegenüber SARS-CoV sowie weiterer respiratorischer Viren, welche ein ähnliches klinisches Bild hervorrufen, geachtet werden. Da der Nachweis von SARS-CoV-2 aus Nasen-/ Rachenabstrichen erfolgen soll, muss zusätzlich eine Kreuzreaktivität mit humaner DNA ausgeschlossen sein. Ist eine Sondensequenz gefunden, die alle theoretischen Bedingungen erfüllt, werden zwei bis vier Paare fl ankierender Primer aus der von PrimedRPA generierten Liste ausgewählt. Nach der Synthese der Primerpaare und der Sonde wird jede mögliche Kombination aus Vorwärtsund Rückwärtsprimer in Kombination mit der Sonde getestet. Als Zielsequenz wird ein in vitro-Transkript des SARS-CoV-2 N-Gens hang mit weiteren Designregeln bezüglich Homo-und Heterodimerbildung von exo-Sonde und Primern führt dieses oft zu Einschränkungen in der Wahl der Zielsequenz [7] . Unsere Arbeitsgruppe konnte jedoch kürzlich mit der Entwicklung des exo-IQ (internally quenched)-Sondenprinzips eine Lösung für dieses Problem präsentieren [8] . 

2019-nCoV) Realtime rRT-PCR panel primers and probes

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06) DNA detection using recombination proteins

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Rapid detection of SARS-CoV-2 by low volume real-time single tube reverse transcription recomb inase polymerase amplifi cation using an exo probe with an internally linked quencher (exo-IQ)

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Diagnostics-in-a-Suitcase: Development of a portable and rapid assay for the detection of the em erging avian infl uenza A (H7N9) virus

Wissenschaftlicher Mitarbeiter an der Profess ur für Sen soren, IMTEK, Universität Freiburg. Seit 2016 Doktorand an der Universität Freiburg und der Medizinischen Hochschule Brandenburg

Biologiestudium an der Universität Freiburg