key: cord-0892916-sgtw5lxt
authors: Gouriet, F.; Raoult, D.
title: Diagnostic microbiologique : du diagnostic par étiologie au diagnostic par syndrome
date: 2008-11-29
journal: Antibiotiques (Paris)
DOI: 10.1016/j.antib.2008.10.002
sha: 9973dbed24960f706d17a9dc42521adc2ae5c673
doc_id: 892916
cord_uid: sgtw5lxt

OBJECTIVES: Over the past decade, the introduction of techniques of molecular biology and the automation have undergone important changes in the practice of clinical microbiological laboratories. METHODS: Commonly, physician prescriptions are etiology driven for emerging infectious agent. The improving in test standardization and rapidity and the best communication between physician and clinical microbiologist lead to profound changes in microbiology laboratories. RESULTS AND CONCLUSION: The present review summarizes the recent development in multiplexed microbiological technology adapted to syndrome driven diagnosis, including sampling strategy, DNA microarray and antigenic microarray.

Multiplexage ; PCR ; Sérologie ; Diagnostic ; Microbiologie ; Syndrome

Objectifs. -Depuis les dix dernières années, l'introduction de la biologie moléculaire et l'automatisation ont radicalement changé les pratiques dans les laboratoires de microbiologie clinique. L'amélioration de la communication entre les microbiologistes et les cliniciens ainsi que les évolutions technologiques telles que la standardisation et le développement de tests diagnostics plus rapides ont conduit à une réorganisation des laboratoires de microbiologie.

Méthodes. -Jusqu'à présent la prescription des examens ciblait un diagnostic étiologique précis, actuellement l'évolution se fait vers le diagnostic par syndrome incluant un panel de tests regroupant les étiologies responsables d'un syndrome donné y compris les pathogènes émergents. Methods. -Commonly, physician prescriptions are etiology driven for emerging infectious agent. The improving in test standardization and rapidity and the best communication between physician and clinical microbiologist lead to profound changes in microbiology laboratories.

Depuis ces dix dernières années, les avancées technologiques telles que l'apport de la biologie moléculaire, l'automatisation de la bactériologie (incubation et détection de la croissance bactérienne dans les flacons d'hémoculture, identification bactérienne et réalisation d'antibiogrammes), ont contribué au changement des pratiques dans les laboratoires de microbiologie [1] . En effet, aujourd'hui le diagnostic en microbiologie est guidé par la recherche d'une étiologie précise. Il est prescrit pour identifier la présence d'un microorganisme particulier dans un échantillon donné. Par exemple, le liquide céphalorachidien peut être adressé au laboratoire de microbiologie pour la recherche isolée de l'herpès simplex virus de type 1 dans le cadre d'une méningoencéphalite, ou encore un frottis sanguin peut être adressé uniquement pour la recherche de Plasmodium sp. dans le cadre d'une fièvre au retour des tropiques. Cependant, le besoin émerge de prescrire un panel de tests qui corresponde à un syndrome donné. Par exemple, lorsqu'une culture de prélèvement biopsique ou encore de sang, est adressée au laboratoire, la recherche de bactérie et de champignon est systématique. La tâche du microbiologiste est difficile et représente un véritable défi, puisqu'il doit anticiper les techniques à mettre en oeuvre pour rechercher les différents microorganismes potentiellement présents dans les échantillons biologiques qui lui sont soumis. L'optimisation du diagnostic microbiologique repose sur des méthodes de diagnostic direct des pathogènes telles que la culture axénique ou cellulaire, la microcopie électronique, la cytométrie en flux, l'immunofluorescence directe [2] , la polymerase chain reaction (PCR), ou les méthodes de diagnostic indirect par sérologie. Le nombre d'agents infectieux détectés pouvant être testés simultanément est illimité, une stratégie de diagnostic par syndrome peut être développée au sein du laboratoire de microbiologie. Au sein de notre laboratoire de microbiologie, nous avons développé une stratégie de diagnostic exhaustive par syndrome. Elle est mise en place depuis plus de dix ans sous forme de « kits » regroupant la recherche d'agents étiologiques dans des thématiques diverses (Tableau 1) telles que les pneumopathies nosocomiales [3] , les fièvres au retour d'un pays tropical [4] , les arthrites et les ostéites [5] , les endocardites [6] , les péricardites [7, 8] les uvéites [9] , les méningoencéphali- [13] , bactériennes [14] , parasitaires [15] , fungiques ou mixtes. En microbiologie, l'identification de tous les microorganismes, par analyse des séquences de l'ADN 16S ribosomal, présents dans les échantillons biologiques, constitue une étape préliminaire à la métagénomique. En effet, l'identification de nouveaux pathogènes a été possible grâce à l'étude des séquences de l'ADN 16S ribosomal, par exemple, dans le cadre des vaginoses bactériennes [16] , des prélèvements respiratoires chez les mucoviscidosiques [17] , des ostéites [5] . Les tests moléculaires sont plus sensibles que les techniques traditionnelles, notamment pour le diagnostic des infections virales ou bactériennes, ou lors de la prise d'antibiotiques. Cependant, les méthodes conventionnelles restent les outils les plus utilisés en routine et demeurent très importantes en matière de diagnostic des pathologies infectieuses. L'évolution technologique des microarray protéiques offrent actuellement la perspective d'effectuer le sérodiagnostic des maladies infectieuses en déterminant de façon simultanée et multiparamétrique la détection de pathogènes et ou de différentes classes spécifiques d'anti-corps dirigés (IgG, M, A) contre plusieurs antigènes bactériens et viraux [18] .

La recherche d'anticorps spécifiques dirigés contre les agents infectieux, présents dans le sérum du patient, reste un outil utile pour le diagnostic microbiologique indirect en maladies infectieuses [19] . En effet, le sérum est facile à obtenir, il peut être conservé sur du papier buvard [20] . Les anticorps sont des protéines relativement stables qui montrent une excellente spécificité et une forte affinité vis-à-vis de leur antigène. La réaction d'immunofluorescence indirecte est l'une des techniques sérologiques la plus couramment utilisée en routine, elle est sensible, spécifique et adaptable [21] . Dans notre laboratoire, Centre national de référence des rickettsioses, nous effectuons quotidiennement le sérodiagnostic des infections à bactéries intracellulaires de culture difficile causées par les différentes espèces de rickettsies, Coxiella burnetii, Bartonella sp., F. tularensis et Ehrlichia. Nous utilisons l'immunofluorescence indirecte, qui est actuellement la technique de référence pour le sérodiagnostic des rickettsioses. Nous avons adapté cette technique sous forme de microméthode permettant la détection simultanée des agents infectieux cités ci-dessus. Tous les antigènes utilisés sont produits au laboratoire selon des procédures déjà décrites [22] [23] [24] [25] . Les antigènes sont déposés au moyen d'une plume sur une lame de verre six puits (Themo Scientific, Portsmouth, États-Unis). Chaque puits peut contenir jusqu'à cinq antigènes. Ainsi tous les sérums envoyés au Centre national de référence dans le cadre d'une fièvre éruptive avec ou sans notion de piqûre d'arthropode font l'objet d'un dépistage systématique qui comprend un panel de dix à 15 antigènes spécifiques en fonction de l'origine géographique du prélèvement (Europe, Asie, Amérique ou Afrique) (Tableau 2). Ces sérums sont quantifiés en IgG, en IgM et en IgA pour C. burnetii. Tous les sérums adressés pour le diagnostic des endocardites infectieuses à hémocultures négatives, de péricardites ou d'adénopathies font également l'objet d'un dépistage systématique d'un panel d'antigènes (Tableau 2). Cette attitude systématique nous a permis d'effectuer le diagnostic de co-infection à C. burnetii et maladies transmises par les arthropodes [26] , de péricardite à C. burnetii non évoqué au moment du diagnostic de la péricardite [27] . Dans le cadre des adénopathies adressées au laboratoire pour le diagnostic de la maladie des griffes du chat, nous effectuons un dépistage sérologique systématique de B. henselae, B. quintana, C. burnetii et F. tularensis. Cela nous a permis d'effectuer le diagnostic de cas de fièvre Q [28] et de cas de tularémie, non suspectés au départ par le clinicien. De plus, cette attitude sérologique systématique est complétée par une analyse en culture standard et cellulaire, par une analyse en biologie moléculaire et en anatomopathologie. Nous avons effectué le diagnostic de maladie de griffes du chat, mais aussi de tuberculose ganglionnaire et de néoplasies [29] . Des lames d'immunofluorescence indirecte multiplexée Biochip Mosaics TM , commercialisées par Euroimmun 1 (Luebeck, Allemagne) destinées au sérodiagnostic des maladies infectieuses sont également actuellement disponibles.

La technologie des puces à biomolécules a pris naissance à la suite des travaux de Roger Ekins, décrivant les avantages potentiels d'un système miniaturisé, les microspots, par rapport à d'autres systèmes d'étude des interactions moléculaires ont de nombreuses applications en maladie infectieuse [30] [31] [32] . Actuellement, le développement de la technologie à haut débit des puces à protéines a permis la miniaturisation des tests conventionnels. Au cours de ces dix dernières années, le séquençage des génomes microbiens associé au développement des outils informatiques, ont permis d'identifier des biomarqueurs antigéniques spécifiques et immunoprotéomiques. Ces récentes avancées en matière de bioinformatique et de spectroscopie de masse ont un rôle important en matière d'identification des protéines. L'application de l'étude du protéome au sérodiagnostic des microorganismes pathogènes tels que immunoblot, l'électrophorèse bidimensionnelle constitue le point de départ de l'identification à haut débit de nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques et de nouvelles cibles antimicrobiennes. Cette approche a été utilisée pour le diagnostic des infections à Tropheryma whipplei [33] . Ces antigènes ou biomarqueurs identifiés peuvent être produits en utilisant des protéines recombinantes et être utilisés pour des puces antigéniques à visée diagnostique. Les tests antigéniques multiplexés offrent la possibilité de pouvoir déterminer de façon simultanée et multiparamétrique les sous-classes d'immunoglobulines (G, M, A) spécifiques dirigés contre plusieurs pathogènes viraux, bactériens ou parasitaires. Une des premières micropuces « antiinfectieuses » développée concernait les antigènes responsables du TorCH syndrome [18] . De plus, le développement des tests multiplexés protéiques utilisant l'immunofluorescence indirecte a été favorisée par la nouvelle génération de fluorophores [34] . La plupart des puces protéiques antigéniques sont construites sur des surfaces planes (lame de verre, membrane). La détection des anticorps se fait sur le principe de la détection de la fluorescence. Celle-ci est automatisée, la lecture se faisant au moyen d'un scanner, la quantification de la fluorescence est réalisée à partir de courbe de calibration interne [18] . L'automatisation de ces techniques sérologiques offre la possibilité de standardiser l'immunofluorescence indirecte, réduisant ainsi les variabilités inter-et intralaboratoire. La société InoDiag 1 (La Ciotat, France) a développé des puces multiplexées pour le sérodiagnostic par syndrome en maladies infectieuses, qui a l'avantage d'utiliser l'immunofluorescence indirecte et d'être totalement automatisée. Les puces antigéniques ont d'autres applications et peuvent jouer un rôle novateur dans l'identification bactérienne. Elles ont été utilisées pour le sérotypage de bactéries tel que Salmonella [35] ou Bartonella sp. [36] .

L'utilisation de suspension array créée par l'immobilisation des antigènes ou des anticorps sur une surface représentée par des microsphères associées à une analyse par cytométrie en flux, est une solution alternative pour le diagnostic multiplexé. La cytométrie en flux est une méthode automatisée, initialement développée pour mesurer les caractéristiques optiques et fluorescentes des cellules ou des particules en solution. Les cytomètres en flux sont de plus en plus performants, ainsi des cytomètres conventionnels et hybrides ont fait leur apparition. Dans ces cytomètres, le même laser est utilisé pour générer tous les signaux. Leur utilisation offre la possibilité de standardiser les tests multiplexés dans le cadre des maladies infectieuses [37] . Plus récemment, des cytomètres en flux dédiés aux suspension array incluant les tests multiplexés désignés pour plus de 100 opérations, ont été développés (« Luminex 100 » Corporation (Austin TX, États-Unis). La [39] . Elle a également été utilisée pour la détection multiplexée d'anticorps spécifiques dirigés contre quatre agents responsables de bioterrorisme [12] .

Les puces à ADN ou DNA microarray Une puce à ADN ou DNA microarray est constituée de fragments d'ADN immobilisés sur un support solide selon une disposition ordonnée. D'abord conçues sur des membranes poreuses de nylon (appelées parfois macro-arrays par opposition aux microarrays), les puces à ADN ont été progressivement mises au point sur lames de verre. Les progrès de la robotique permettent aujourd'hui de fabriquer des puces comportant une très haute densité de spots, susceptibles de recouvrir l'intégralité du génome d'un organisme sur une simple lame de verre. Les applications des microarrays en microbiologie s'étendent sur plusieurs domaines : la détection et l'identification des microorganismes, l'analyse de l'expression des gènes. Plusieurs types de puces sont utilisées selon la densité des spots, leur mode de fabrication, la nature des fragments fixés à leur surface et les méthodes d'hybridation [40] . On distingue essentiellement deux types de puces : les puces dites « spottées » par un dépôt robotisé de produits de PCR ou de longs fragments oligonucléiques (spotted microarrays) et les puces à oligonucléotides synthétisés in situ par photolithographie (GeneChips de la société Affymetrix) ou par impression « jet d'encre » (Agilent Technologies/Rosetta Inpharmaceutics). Ces dernières ne peuvent être produites que par des sociétés industrielles. Les sondes peuvent être des produits de PCR ou de fragments oligonucléiques et les cibles de l'ADN complémentaire, de l'ADN génomique, des produits de PCR, ARN total, de l'ARN amplifié, de l'ADN plasmidique, ou encore une suspension bactérienne ou un échantillon clinique [41] . Lorsque la PCR est utilisée pour détecter l'ADN dans les échantillons cliniques, les microarrays peuvent alors être employées pour identifier les produits amplifiés en les hybridant sur une puce constituée de sondes spécifiques de pathogènes donnés. L'utilisation d'amorces universelles telles que celles amplifiant le gène, l'ADN 16 S ou 23 S ribosomal, permet la détection de nombreux pathogènes simultanément grâce au microarrays en utilisant une seule PCR [42] . Les DNA microarrays peuvent également être utilisés pour l'identification des souches ou le génotypage, lorsqu'elles incorporent des gènes cibles spécifiques d'espèces, des profils de réactivité des souches de référence et des souches à comparer. Les applications des DNA microarrays sont nombreuses. Elles ont été utilisées pour effectuer la détection et le génotypage des Listeria [43] des rotavirus [44] , de virus au sein de prélèvements tissulaires et respiratoires [45] . Un oligonucléotide microarray permettant une détection de tous les microorganismes (parasitaires, fungiques, bactériennes, viraux) a également été développé pour le diagnostic en maladies infectieuses [46] .

La PCR multiplexée est une variante de la PCR dans laquelle une ou plusieurs séquences cibles peuvent être amplifiées en incluant une ou plusieurs paires d'amorces dans la même réaction [47] . Les paramètres clés influençant la PCR multiplexée sont décrits ci dessous. Pour obtenir une amplification hautement spécifique des produits de la PCR multiplexée : la concentration relative des amorces et du tampon, la balance entre le chlorite de magnésium, la concentration en désoxynucléotide, les cycles de températures, la quantité d'ADN matrice et la Taq DNA polymérase sont essentiels. Mais les paramètres les plus importants sont la température d'élongation qui doit être optimale, la concentration en tampon et la proportionnalité entre la concentration de chlorite de magnésium et la quantité de dNTP. Le problème le plus communément rencontré en multiplex PCR est l'amplification de produits non spécifiques due à la présence de plusieurs paires d'amorces, ou au manque de spécificité de ceux-ci. Le choix des amorces est également une étape importante. La PCR en temps réel est une technologie basée sur la détection d'oligonucléotides marqués avec un fluorophore. Un des aspect les plus intéressants de cette technique est la possibilité de détecter plusieurs cibles dans la même réaction de PCR [48] . Le développement de PCR multiplex en temps réel a été limité à cause du nombre de fluorophores disponibles et à cause de la superposition de leur émission spectrale. Plusieurs approches de PCR quantitative sont utilisées selon des mécanismes conduisant à l'augmentation de la fluorescence au cours de l'amplification. En effet, l'émission de fluorescence peut se faire par un agent intercalant (e.g., SybrGreen 1 I) inséré dans de l'ADN double brin. La libération de fluorescence peut également reposer sur l'activité 5'-3' exonucléase de la Taq polymérase s'exerçant sur une sonde (e.g., TaqMan 1 ) dont la dégradation, au cours de l'élongation d'un fragment PCR, permet de lever l'action inhibitrice d'un quencher sur un fluorophore ; l'hybridation d'une sonde (e.g., Molecular Beacon 1 , QuantiProbe TM ) lors de son hybridation sur sa séquence cible conduit à la levée, par éloignement, de l'action inhibitrice d'un quencher sur un fluorophore. Lors de l'étape d'élongation, la sonde est décrochée, mais non dégradée. La libération de la fluorescence peut se faire par transfert d'énergie de résonance (FRET) lors de l'hybridation de deux sondes (e.g., LightCycler 1 hybridization probes) sur leur séquence cible conduisant à un rapprochement des fluorophores. Lors de l'étape d'élongation, les sondes sont décrochées, mais non dégradées. La PCR multiplexée en temps réel a l'avantage d'économiser du temps ce qui offre la possibilité de réorganiser le travail dans les laboratoires. Depuis son développement, la PCR multiplexée a été utilisée dans de nombreux domaines d'analyse des acides nucléiques, incluant l'analyse des délétions de gènes, les mutations et les analyses du polymorphisme, les analyses quantitatives, la détection d'ARN. Récemment, Roche Diagnostics a développé une plateforme de PCR en temps réel qui utilise une lampe au xénon et cinq filtres de bandes passantes pour l'excitation des fluorophores à cinq longueurs d'ondes fixes combinée à six filtres de bandes passantes pour la détection de l'émission des fluorophores à six longueurs d'ondes fixes différentes. Cette nouvelle plateforme est particulièrement adaptée à la PCR multiplex en temps réel [49] . L'application des ces PCR multiplexés dans la littérature sont nombreuses en maladies infectieuses adaptées au diagnostic spécifique d'organe ou de syndrome (Tableau 3).

La spectrométrie de masse a largement été utilisée pour la caractérisation phénotypique de bactéries entières [50] , de simple lysat cellulaire ou de produit bactérien tels que le lipopolysaccharide et les protéines [51] . Elle peut être utilisée pour analyser les ADN et les ARN bactériens. Elle a été employée pour la différentiation rapide des produits de PCR pour les bactéries méthanotrophes en fonction de leur taille [52] . L'identification moléculaire des bactéries peut être basée sur le séquençage du gène de l'ADN 16S ribosomal, qui est une technique longue et qui nécessite l'obtention d'une culture pure. L'analyse par spectrométrie de masse basée sur un modèle de clivage spécifique de produit de PCR amplifié a été récemment utilisée pour l'identification rapide d'isolats bactériens dans un environnement complexe [53] . (Fig. 2) . Le diagnostic de telles infections repose sur la sérologie. L'immunofluorescence indirecte est la méthode de référence [62] . bactériose a été diagnostiquée chez 54 patients (6,9 %) en culture, ce résultat a été confirmé rétrospectivement par PCR. Un cancer a été détecté chez 47 patients. De plus, 13 patients avec une maladie des griffes du chat présentaient une co-infection à mycobactérie (dix cas) ou une néoplasie (trois cas) [29] . De plus, dans 50 % des cas des sérums adressés au laboratoire pour suspicion de maladies des griffes du chat ou bilan d'adénopathie, notre stratégie de diagnostic exhaustive nous a permis d'identifier des cas de tularémie (données non publiées). Au cours de l'année 2007, nous avons déclaré 13 cas de tularémie sur les 20 déclarés en France.

Au cours du bioterrorisme, le développement de microarrays a été adapté à la détection des agents infectieux impliqués dans ces pathologies [68, 69] . Biagini 

Monsieur Raoult est un co-fondateur de la société InoDiag.

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